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      業(yè)內(nèi)資訊

      多功能單細胞顯微操作FluidFM技術首次實現(xiàn)活細胞間線粒體移植

      文字:[大][中][小] 手機頁面二維碼 2023/3/3     瀏覽次數(shù):    
        摘要:

        線粒體和復雜的內(nèi)膜系統(tǒng)是真核細胞的重要特征。到目前為止,對活細胞內(nèi)的細胞器進行操縱仍然十分困難。多功能單細胞顯微操作FluidFM技術能夠從活細胞中提取、注射細胞器,將定量的線粒體移植到細胞中,同時保持它們的活力。

        近期,Julia A.Vorholt課題組使用多功能單細胞顯微操作FluidFM技術,將線粒體移植至培養(yǎng)的細胞中,并實時跟蹤線粒體注射后的情況,監(jiān)測它們在新宿主細胞中的命運。通過跟蹤,作者發(fā)現(xiàn)與受體細胞線粒體網(wǎng)絡融合發(fā)生在移植后20分鐘,持續(xù)16小時以上?;罴毎g移植線粒體不僅為細胞器生理學的研究開辟了新的前景,也為機械生物學、合成生物學和疾病治療開辟了新的前景。該篇文章以”Mitochondria transplantation between living cells.”為題,發(fā)表在BioRxiv.上。

        結果:

        1.從活細胞中提取線粒體

        為了檢測FluidFM探針對單細胞細胞器采樣的能力。作者使用了兩種探針,分別是錐型探針(A=1.2 um2)和圓柱型探針(A=1.6 um2)(圖1B)。實驗結果表明,使用這兩種探針都可以對線粒體及單個線粒體進行提取或大量抽提。

        作者對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和線粒體提取后的細胞活力進行了檢測,發(fā)現(xiàn)細胞仍保持較高的細胞活力(&gt;95%)。為了進一步確保FluidFM提取方案在探針插入時不會破壞細胞質(zhì)膜,作者使用熒光探針(mito-R-GECO1)監(jiān)測細胞培養(yǎng)基中可能發(fā)生的Ca2+內(nèi)流。實驗顯示,在操作過程中和操作后都沒有Ca2+流入,表明細胞器提取過程中細胞質(zhì)膜的完整性。

        本研究還發(fā)現(xiàn)暴露在FluidFM負壓下的線粒體小體會經(jīng)歷形狀的轉(zhuǎn)變,類似于“串上珍珠”的形態(tài)。其特征是離散的線粒體基質(zhì)球體狀,并且通過細長的膜結構相互連接,在進一步負壓拉力的作用下,這些球狀結構最終被拉斷,并在懸臂中呈現(xiàn)為球狀線粒體(圖2E)。進一步探究顯示,施加FluidFM負壓后,力誘導的形狀轉(zhuǎn)變沿線粒體小管在毫秒到秒的范圍內(nèi)傳播了數(shù)十微米。形狀轉(zhuǎn)變沿這一方向均勻傳播,而外層線粒體膜(OMM)保持了最初的完整性。當牽引力保持數(shù)秒后,OMM在先前形成的“珍珠”之間的一個或多個收縮點分離,從而產(chǎn)生獨立的球形線粒體,而管狀結構的其余部分放松并恢復。結合線粒體牽引實驗和線粒體定位的鈣流實驗,結果證明線粒體的串上珍珠表型的形狀轉(zhuǎn)變以及隨后細胞質(zhì)內(nèi)的線粒體裂變是不依賴鈣的。



        圖1:(A)示意圖:使用FluidFM技術進行細胞器提取。通過調(diào)整懸臂探針中的負壓(-Δp)進行提取。(B)通過調(diào)節(jié)孔徑大小和流體作用力的適用范圍,選擇性地提取不同的細胞器成分。第1行:用懸梁臂探針提取單細胞細胞器的示意圖。第2行:不同孔徑的懸臂尖掃描電鏡圖。第3行:FluidFM懸臂探針孔徑與對應的流體力范圍。(C)示意圖:使用FluidFM技術進行細胞器注射。通過調(diào)整懸臂探針中的正壓(+Δp)進行將探針中的細胞器注射到受體細胞內(nèi)。



        圖2:(A)FluidFM懸臂探針的掃描電子顯微鏡圖像。具體尺寸參數(shù)是:L=200μm,W=35μm,H=1μm。Scale bar=5μm。(B)提取線粒體后的FluidFM懸臂的熒光顯微鏡圖像。由于折射率不同,可以看到提取物和懸臂探針填充物之間的邊界。Scale bar=10μm。(C)是圖(B)的示意圖,提取物的體積是1170 fL。(D-F)活細胞器提取的延時圖像和提取后金字塔懸臂圖像。黃框表示細胞內(nèi)的懸臂尖的位置。(D)對表達su9-BFP(線粒體)和Sec61-GFP(ER)的U2OS細胞進行提取。箭頭表示ER區(qū)域。使用孔徑為0.5μm2的懸臂梁探針。Scale bar=10μm。(E)從表達su9-BFP的U2OS細胞中提取單個線粒體。使用1μm2孔徑的懸臂梁探針。Scale bar=10μm。(F)從表達su9-BFP的U2OS細胞中提取數(shù)個線粒體。使用1μm2孔徑的懸臂梁探針。Scale bar=10μm。

        2.線粒體移植至新細胞

        研究人員的下一個目標是將線粒體移植到新的宿主細胞中,并保持細胞活性。FluidFM技術為線粒體轉(zhuǎn)移提供了兩種可能性方案:方案一、用FluidFM技術直接提取線粒體而后注入到新的宿主細胞中;方案二、將從細胞中分離純化的線粒體回充入FluidFM探針,然后注射(圖3A-D)。作者比較了兩種方法,為了實現(xiàn)可視化的線粒體的轉(zhuǎn)移,作者在供體和受體細胞中分別對線粒體進行了差異化標記(圖3E-F;供體細胞線粒體su9-mCherry和受體細胞線粒體su9-BFP)。當使用FluidFM直接將線粒體從一個細胞移植到另一個細胞時,成功率高達95%,而且保持了細胞活力(圖3G,41個移植細胞中有39個)。在注射純化線粒體后,作者觀察到46%的樣本(19/41)發(fā)生了線粒體轉(zhuǎn)移且保持了細胞活力(圖3G)。移植的定量結果顯示,這些實驗中移植的線粒體數(shù)量從3到15個線粒體每個細胞不等(圖3H)。兩種替代方案的不同成功率可以由線粒體分離獲取的條件差異來解釋。在評估線粒體提取方案時,作者觀察到部分提取的線粒體外膜發(fā)生破裂。線粒體的不可逆損傷導致細胞內(nèi)降解,細胞色素C釋放可能導致細胞凋亡。

        雖然線粒體的細胞間移植降低了通量,但它的優(yōu)點是細胞外時間短(&lt;1分鐘),并且通過FluidFM采樣的線粒體大限度地集中在原生細胞質(zhì)液中,完全避免了人工緩沖液的使用。在提取和移植之前,作者通過在探針中填充不混溶的C8F18來確保提取液在提取過程中保持在孔徑附近。因此,只有很小的體積(0.5-2pL)被注入到宿主細胞中(圖3B)。

        除了標記供體細胞的線粒體(su9-mCherry)外,還標記了受體細胞的線粒體(su9-BFP),這樣就能夠觀察移植細胞線粒體網(wǎng)絡的實時狀態(tài)。在上述兩種移植方案(移植和純化后注射)中,宿主-線粒體網(wǎng)絡的管狀狀態(tài)不會因注射過程而產(chǎn)生影響。此外,標記可以讓作者可視化地監(jiān)測線粒體地移植,觀察線粒體地融合。無論移植方法是細胞到細胞(圖3I),還是注射純化線粒體(圖3J),都可以觀察到這些過程。實驗跟蹤了22個細胞的移植命運:18個細胞顯示移植的線粒體完全融合,4個細胞的線粒體發(fā)生降解。多數(shù)細胞樣本(18個細胞中的14個)在移植后30分鐘內(nèi)初次觀察到融合事件。

        如上所述,細胞間移植即方案一的效率高,并可以直接觀察單個移植線粒體的命運。為了展示這一點,作者將標記好的線粒體(su9-mCherry)從HeLa細胞移植到差異標記的U2OS細胞(su9-BFP)中,這種細胞通常用于研究動態(tài)線粒體行為。高靈敏度相機可以用于追蹤受體細胞內(nèi)的單個線粒體(圖3L)。作者觀察到熒光線粒體基質(zhì)標簽在移植后23分鐘的發(fā)生初始融合而后擴展到線粒體網(wǎng)絡。

        綜上所述,作者建立了兩種將線粒體轉(zhuǎn)移到單個培養(yǎng)細胞的方法。一種方法是活細胞間移植。該方案顯示移植后細胞活力高,允許觀察移植后線粒體的動態(tài)行為,是一種高效方案。第二種方法是大量純化線粒體并將其注射到受體細胞中。注射速度相當快,但不可避免地損害線粒體和細胞功能。



        圖3:(A)方案一示意圖(活細胞間線粒體移植):通過FluidFM吸入法提取線粒體。隨后,將帶有提取物的懸臂探針移至受體細胞插入并注入提取物。(B)方案一預填充C8F18的FluidFM懸臂梁的圖像,被移植線粒體通過su9-mCherry標記,提取量~0.8 pL。Scale bar=10μm。(C)方案二示意圖(純化線粒體注入細胞):使用標準線粒體純化方案純化的線粒體進行線粒體移植的方案。將純化的線粒體重懸在HEPES-2緩沖液中,直接填充到FluidFM探針中并對細胞進行注射。(D)方案二由su9-mCherry標記的FluidFM懸臂充滿線粒體的圖像。Scale bar=10μm。(E)通過方案一(活細胞間線粒體移植)進行線粒體移植后的宿主細胞圖像。宿主細胞的線粒體通過su9-BFP標記,移植細胞線粒體通過su9-mCherry標記。Scale bar=10μm。

        (F)通過方案二(純化線粒體注入細胞)進行線粒體移植后的受體細胞圖像。宿主細胞的線粒體通過su9-BFP標記,移植細胞線粒體通過su9-mCherry標記。Scale bar=10μm。(G)通過光學成像對兩種方案注射的細胞進行評估。每種方法評估了40個細胞。(H)兩種方案的線粒體的絕對計數(shù)評估。每種方法評估了22個細胞。(I)方案一移植線粒體后,對移植線粒體(su9-mCherry)和宿主線粒體網(wǎng)絡(su9-BFP)使用不同的熒光標記進行成像,融合。Scale bar=5μm。(J)方案二注入純化線粒體后移的融合狀態(tài),標記方案同(I)。Scale bar=5μm。(K)移植線粒體發(fā)生降解,分裂成多個更小的熒光囊泡(su9-mCherry),熒光與標記的宿主細胞線粒體網(wǎng)絡(su9-BFP)沒有重疊。Scale bar=5μm。(L)單個移植線粒體的延時圖像序列(su9-mCherry)。細胞器供體為HeLa細胞,受體細胞為U2OS細胞,帶有熒光標記線粒體網(wǎng)絡(su9-BFP)。Scale bar=10μm。

        討論

        單細胞的操縱一直是細胞生物學領域的熱點和難點,尤其是在不損害細胞活力的情況下從細胞中提取細胞器或?qū)⑼庠次镔|(zhì)直接導入到細胞中。截止到目前,盡管單細胞技術有了較大的發(fā)展,但要實現(xiàn)將細胞器從一個細胞移植到另一個細胞,除了更大的卵母細胞外,幾乎是不可能實現(xiàn)的。

        線粒體是細胞中的能量轉(zhuǎn)換的核心,與細胞代謝和信號通路以及細胞命運緊密聯(lián)系在一起。線粒體含有自身的遺傳成分(mtDNA),通常是嚴格垂直遺傳給子細胞的。目前將線粒體準確地轉(zhuǎn)移到細胞的手段有限,對于線粒體移植后的劑量-反應關系分析更是十分困難,這樣我們就很難從機制上了解健康或疾病細胞的線粒體移植后的生物學效應。

        本文使用的FluidFM技術采用微型探針,可以在微環(huán)境中以高時空分辨率操縱單細胞或者對單個細胞進行采樣,并與組學方法相結合,使細胞器的研究成為可能。FluidFM技術將原子力顯微鏡的高精度力學調(diào)節(jié)手段與光學檢測下的納米尺度微流控系統(tǒng)相結合,提供與單細胞操作相關的力學和定量的體積控制。這些特性在現(xiàn)有微型探針中是的,在本研究中,作者將FluidFM單細胞技術用于活細胞真核內(nèi)和細胞間的細胞器微操作。成功實現(xiàn)了活細胞之間的線粒體移植。

        該研究將啟發(fā)人們將FluidFM技術應用于更多領域,例如,干細胞治療中低代謝活性細胞的再生,作為線粒體替代治療方法的一種備選方案等。此外,F(xiàn)luidFM技術為解決細胞生物學、生物力學和細胞工程等問題提供了新的視角。

        多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)-FluidFM OMNIUM


        參考文獻

        [1].C.G?belein,Q.Feng,E.Sarajlic,T.Zambelli,O.Guillaume-Gentil,B.Kornmann&J.Vorholt.Mitochondria transplantation between living cells.(2021).BioRxiv.
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