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      電轉(zhuǎn)儀助力CRISPR編輯iPSC新進展首次報告協(xié)同基因編輯效應

      文字:[大][中][小] 手機頁面二維碼 2023/3/3     瀏覽次數(shù):    




        2006年,日本科學家山中伸彌(Shinya Yamanaka)教授利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將4個轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入成體細胞,將其轉(zhuǎn)變?yōu)檎T導多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)。從此后,誘導多潛能干細胞研究領(lǐng)域取得了很大進步,被用于研究人類疾病,目前已經(jīng)有多項研究進入到臨床實驗階段。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)已成為目前常使用的基因編輯工具,在基因組中生成靶向DNA雙鏈斷裂(Double strand breaks,DSBs),再通過內(nèi)源性細胞DNA DSB修復途徑進行修復。將CRISPR技術(shù)與iPSC技術(shù)結(jié)合,將模擬疾病發(fā)生的突變引入iPSC,或修復iPSC疾病模型中的突變,再分化得到所需要的特定細胞進行研究或疾病治療,是目前iPSC研究和轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的熱點。

        目前,基于CRISPR/Cas9技術(shù)在靶向區(qū)域形成DNA雙鏈斷裂(DSB),利用非同源末端連接(Non-Homologous End Joining,NHEJ)方法導致插入和缺失突變,而微同源性末端連接(Microhomology-Mediated end Joining,MMEJ)則導致可預測缺失。NHEJ和MMEJ統(tǒng)稱為誘變末端連接(Mutagenic End Joining,MutEJ),兩種修復結(jié)果均可導致DNA序列的丟失或增加。與定制修復模板如供體質(zhì)?;騿捂湽w寡核苷酸(Single-stranded donor oligonucleotide,ssODN)結(jié)合,利用同源定向修復(Homology-directed repair,HDR)途徑可實現(xiàn)單核苷酸改變。然而基因準確敲入效率低下和適用性有限,需要采用定制ssODN模板進行優(yōu)化HDR編輯效率。

        HDR方式是復雜而準確的,需要同源序列模板,只能發(fā)生在細胞G2/S期。NHEJ方式是快速非準確的,過程中可能會隨機的引入和去除幾個堿基,整個細胞周期都有活躍發(fā)生的。有多種策略來提高HDR率,如單獨控制DNA修復,細胞周期進程或核酸酶試劑和同源修復模板可用性,但迄今尚無明確證據(jù)表明這些策略的協(xié)同效應。

        日本京都大學iPS細胞研究所的科學家新研究表明(Nature Communications,2020),DNA DSB修復與細胞周期之間有協(xié)同作用,有利于ssOND介導的單核苷酸基因編輯。在iPS細胞中建立了基于GFP到BFP轉(zhuǎn)化的熒光DNA修復測定方法,可視化定量單等位基因和雙等位基因靶向過程中DNA修復結(jié)果的頻率。研究發(fā)現(xiàn),通過特定培養(yǎng)條件和小分子調(diào)節(jié)DNA修復和細胞周期,可協(xié)同增強同源性定向修復(HDR)的頻率。但是,高頻HDR編輯主要導致雙等位基因報告基因系統(tǒng)中純合突變體的產(chǎn)生,為了在這些條件下生產(chǎn)雜合突變體,這個團隊采用了使用混合ssODN修復模板的策略,來保護具有沉默突變的一個等位基因。在內(nèi)源性常染色體位點應用此協(xié)同基因編輯策略,與基線HDR水平相比,準確編輯生成的雜合和純合突變提高了幾倍。

        考慮到基因編輯的iPS細胞在細胞治療中應用,采用符合GMP標準的Maxcyte電轉(zhuǎn)儀測試設(shè)定的實驗條件,比較正常培養(yǎng),冷休克,冷休克和N+S條件下DNA修復結(jié)果頻率,在兩種不同供體遺傳背景下產(chǎn)生雜合和純合GFP iPS細胞系。利用Maxcyte電轉(zhuǎn)技術(shù),在冷休克條件下,結(jié)合XL413和N+S處理,在雜合GFP iPS細胞的單等位基因編輯過程中,同源性定向修復(HDR)結(jié)果達到83.3%,在純合GFP iPS細胞的雙等位基因編輯中,HDR結(jié)果達到了96.6%。此外,當采用混合ssODN M和B修復模板編輯純合GFP iPS細胞時,獲得了32.2%的復合雜合子。實驗人員由此得出,協(xié)同基因編輯導致所有目標基因座上HDR頻率提高了幾倍,證實了該策略在靶向人類基因組方面的廣泛適用性。

        5個基因座(KCNH2 N588D/N588K,APRT M136T,HES7 R25W and PSMB8 G201V)上,在XL+N+S處理下32個克隆中獲得18-23個具有HDR等位基因(56%-72%總HDR效率)。與N+S聯(lián)用時,XL413引起的細胞周期停滯對HDR率的影響強于冷休克處理。其他5個基因座(KCNE1 D85N,KCNH2 N45D,SCN5A A1428S,and KCNJ11 T293N/T294M)的編輯效率低由于gRNA活性低。

        總之,這些結(jié)果證實了,在不同電轉(zhuǎn)儀器和iPS細胞系間,通過細胞周期同步和DNA修復途徑調(diào)節(jié)的協(xié)同基因編輯可有效地產(chǎn)生純合和復合雜合突變克隆。參考圖1


        研究結(jié)論及意義

        研究人員采用化學和細胞培養(yǎng)條件干預措施,在人iPS細胞ssODN介導的基因編輯過程中,試圖使DNA修復結(jié)果偏向于HDR。冷休克已被證明在低溫下對細胞功能有多種影響,例如細胞代謝減慢,凋亡途徑激活,基因表達改變和細胞周期停滯?;蚓庉媽嶒炛?,冷休克可提高HDR效率,但其機制仍不清楚。本研究表明冷休克可減慢細胞周期進程,使細胞處于G2/M期累積,并降低DNA合成速率。另外,冷休克可通過其他細胞周期依賴的效應來表現(xiàn),如核酸酶穩(wěn)定性、gRNA結(jié)合或DNA裂解動力學和修復中間體的穩(wěn)定性,翻譯后調(diào)控和細胞活力。參考圖2


        細胞周期調(diào)節(jié)是DNA修復和基因編輯領(lǐng)域中持續(xù)不斷的研究課題。本研究報道了在iPS細胞中CDC7抑制劑XL413可增強基因編輯。XL413在癌細胞系中在S/G2/M期積聚細胞,在核型正常細胞中阻滯在G1/早S期,與iPS細胞中觀察一致的。

        研究人員發(fā)現(xiàn),NHEJ抑制劑NU7441和SCR7分別提高了iPS細胞中HDR效率,聯(lián)合使用時,進一步提高了HDR效率。DNA-PKcs在DSB形成后被特異性激活,并募集NHEJ途徑的蛋白組分,包括可連接DNA末端的DNA連接酶IV。作者懷疑利用NU7441抑制DNA-PKcs可能會繞過NHEJ復雜的裝配,并允許選擇其他替代DNA修復途徑,而對于下游利用SCR7抑制DNA連接酶IV,細胞可能已經(jīng)致力于利用NHEJ或其他替代MutEJ修復。這可能解釋,與SCR7處理相比,NU7441具有更高的HDR效率。研究人員一次報告細胞周期同步和DNA修復途徑調(diào)節(jié)對準確基因編輯有協(xié)同影響。

        使用本研究的方法,在不同電轉(zhuǎn)平臺間,協(xié)同基因編輯作用結(jié)果相似的。在純合GFP iPS細胞的雙等位基因編輯中,與NEPA Gene電轉(zhuǎn)儀HDR 48.9%比,Maxcyte具有更高的效率,HDR結(jié)果達到了96.6%,編輯效率高了2倍。與以前報道一致,通過準確地單等位基因編輯形成的單個HDR等位基因主要與第二等位基因中插入缺失配對。因此,采用混合ssODN策略來創(chuàng)建可防止Cas9再裂解的復合雜合突變等位基因,當采用混合ssODN M和B修復模板編輯純合GFP iPS細胞時,Maxcyte獲得的復合雜合子比NEPA Gene高了2.9倍(32.2%vs 11.2%)??紤]到基因模型的內(nèi)源性靶標,在多個基因座上實驗產(chǎn)生純合和復合雜合突變,結(jié)果證明協(xié)同基因編輯始終將HDR結(jié)果頻率提高到基線HDR水平的幾倍。

        總之,研究人員建立了一個雙等位基因報告系統(tǒng),該系統(tǒng)能夠解決特定的等位基因DNA修復結(jié)果,并定義了協(xié)同基因編輯條件,可使用冷休克,細胞周期同步和DNA修復調(diào)節(jié)來提高HDR和HDR/MutEJ比率。利用高效的雙等位基因修飾方式,展示了產(chǎn)生復合雜合iPS細胞系的策略。根據(jù)研究結(jié)果可預測,提高雙等位基因編輯結(jié)果的可靠性將促進顯性和隱性遺傳疾病模型的產(chǎn)生,結(jié)合符合GMP標準的轉(zhuǎn)染技術(shù),甚至可能促進使用人iPSC細胞療法的臨床開發(fā)。

        參考文獻:

        Thomas L.Maurissen&Knut Woltjen.Synergistic gene editing in human iPS cells via cell cycle and DNA repair modulation.Nature Communications.08 June 2020

        https://www.nature.com/articles/s41467-020-16643-5#Abs1

        Author:Department of Life Science Frontiers,Center for iPS Cell Research and Application(CiRA),Kyoto University,Kyoto,606-8507,Japan

        關(guān)于Maxcyte公司

        Maxcyte是一家臨床階段細胞免疫治療和生命科學公司,是細胞療法領(lǐng)域早期的先驅(qū)公司之一,總部位于美國馬里蘭州蓋瑟斯堡。作為一家全球運營的生物科技公司,利用專利性的非病毒細胞工程平臺,即流式電轉(zhuǎn)技術(shù)平臺,為全球生物醫(yī)藥行業(yè)的合作伙伴賦能,幫助客戶開發(fā)創(chuàng)新性的細胞療法,來滿足病人對先進細胞療法的需求。利用Maxcyte ExPERT電轉(zhuǎn)平臺結(jié)合基因編輯手段安全高效可高度重復地對人體原代細胞進行遺傳改造,在符合臨床使用的嚴格標準前提下,用于治療遺傳性疾病和癌癥。Maxcyte具有全球技術(shù)支持網(wǎng)絡(luò),目標是幫助合作伙伴釋放它們產(chǎn)品的所有潛能。

        Maxcyte已被全球范圍內(nèi)用戶認可,全球前十制藥公司都采用Maxcyte技術(shù)平臺進行藥物研發(fā),歐美主要基因編輯和細胞治療公司與Maxcyte合作進行新型的基因和細胞治療產(chǎn)品開發(fā),如Allogene therapeutics,Editas medicine,CRISPR Therapeutics,Precision biosciences和Kite pharma等。多個頂級學術(shù)研究機構(gòu)采用Maxcyte技術(shù)研究哺乳動物細胞和干細胞,如日本京都大學iPS細胞研究所(CIRA)和美國賓夕法尼亞大學。

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